Description
Type de produit : Non conjugué
Cycle de livraison : spot
Montant: 3000 fois
Présentation du produit
Ce kit de détection de la viabilité cellulaire CCK-8 contient du WST-8 (2-(2-méthoxy-4-nitrophényl)-3-(4-nitrophényl)-5-(2,4-disulfo Benzène)-2H-tétrazole sel monosodique) . En présence de porteurs d’électrons, le WST-8 est oxydé et réduit par la déshydrogénase intracellulaire pour produire des colorants formazan jaune orangé solubles dans l’eau qui peuvent être dissous dans un milieu de culture tissulaire. La quantité de formazan est directement proportionnelle au nombre de cellules vivantes. La méthode CCK-8 est une méthode de détection colorimétrique non radioactive très sensible utilisée pour déterminer le nombre de cellules vivantes dans les expériences de prolifération cellulaire ou de toxicité, qui peut remplacer la méthode MTT traditionnelle.
Apportez vos propres instruments et réactifs en dehors du kit
Centrifugeuse basse vitesse, lecteur de microplaques (longueur d’onde 450 nm), agitateur de plaques, micropipette, plaque de culture 96 puits, incubateur à CO2
Pas
- Ajoutez généralement 100 ul (2000 cellules) par trou pour les expériences de prolifération cellulaire, ajoutez 100 ul (10 000 cellules) par trou pour les expériences de cytotoxicité (le nombre spécifique de cellules utilisées dans chaque trou dépend de la taille des cellules, de la vitesse de prolifération cellulaire , etc.) Les facteurs déterminent). Pré-incuber la plaque de culture dans un incubateur pendant 24 heures (à 37°C, 5% CO2).
- Selon les besoins de l’expérience, cultivez et donnez une stimulation médicamenteuse spécifique de 0 à 10 ul.
- Conserver la plaque de culture dans l’incubateur pendant une durée appropriée (par exemple : 24 heures ou 48 heures).
- Ajouter 10 ul de solution de CCK-8 dans chaque puits. Si le volume de culture initial est de 200 ul, 20 ul de solution de CCK-8 doivent être ajoutés, et le reste peut être déduit par analogie. Les puits avec des quantités correspondantes de milieu de culture cellulaire et de solution de CCK-8 mais aucune cellule peuvent être utilisés comme témoin à blanc. Si vous craignez que les médicaments utilisés n’interfèrent avec le test, vous devez régler les puits avec la quantité correspondante de milieu de culture cellulaire, de médicaments et de solution de CCK-8, mais pas de cellules ajoutées comme contrôle à blanc. (Essayez de ne pas générer de bulles dans le trou)
- Incuber la plaque de culture dans l’incubateur pendant 1 à 4 heures.
- Mesurer l’absorbance à 450 nm avec un lecteur de microplaques.
- Si vous ne souhaitez pas mesurer temporairement la valeur de DO et prévoyez de la mesurer plus tard, vous pouvez ajouter 10 l de solution de HCl 0,1 M ou de solution SDS à 1 % (P/V) dans chaque puits et couvrir la plaque de culture pour éviter allumer et conserver à température ambiante. L’absorbance ne changera pas dans les 24 heures.
Jugement de résultat
(1) Taux de survie des cellules : soustraire la valeur de DO de fond de la valeur de DO de chaque puits de test (milieu complet plus CCK-8, aucune cellule) et prendre la moyenne ± SD pour la valeur de DO de chaque puits répété.
Le taux de survie cellulaire est exprimé en T/C%, T est la valeur de DO des cellules additionnées de médicament et C est la valeur de DO des cellules témoins. Taux de survie cellulaire % = (DO des cellules ajoutées au médicament/DO des cellules témoins) × 100
(2) Trouver la concentration du médicament à T/C = 50 % (IC50) ou la concentration du médicament à T/C = 10 % (IC90).
Conditions de stockage : 4℃ à l’abri de la lumière, valable un an
Précautions
- Faites attention à ce que la suspension cellulaire soit mélangée pendant l’inoculation pour éviter la précipitation des cellules, ce qui entraîne un nombre inégal de cellules dans chaque puits, vous pouvez la mélanger à chaque inoculation de plusieurs puits. Le milieu de culture dans un cercle de trous autour de la plaque de culture est facile à volatiliser. Afin de réduire les erreurs, il est recommandé d’ajouter uniquement du PBS moyen ou stérile à chaque trou sur les quatre côtés de la plaque de culture, et non comme un trou de détection d’index.
- Le meilleur temps de réponse de CCK-8 est soumis au meilleur temps pour le développement de couleurs spécifiques. Lorsque vous faites l’expérience pour la première fois, il est recommandé de faire quelques puits pour connaître le nombre optimal de cellules inoculées et le temps d’incubation optimal après avoir ajouté le réactif CCK-8. Dans des circonstances normales, les globules blancs sont plus difficiles à développer une couleur, donc un temps de réaction CCK-8 plus long ou une augmentation du nombre de cellules (~ 105 cellules/puits) sont nécessaires. Les cellules en suspension sont difficiles à développer une couleur par rapport aux cellules adhérentes. Pour les cellules en suspension, après avoir ajouté CCK-8 et incubé pendant 1 à 4 heures, elles peuvent d’abord être retirées de l’incubateur et le degré de coloration peut être observé visuellement ou déterminé avec un lecteur de microplaques pour déterminer le meilleur temps d’incubation pour la CCK. -8. S’il est difficile de développer la couleur, remettre la plaque de culture dans l’incubateur et continuer à incuber pendant quelques heures avant de mesurer. Pour les cellules adhérentes, le temps d’incubation de la CCK-8 est généralement de 1 à 4 heures. La plupart des cellules peuvent être observées visuellement après 30 minutes d’incubation, et l’effet de détection est optimal lorsqu’elles sont incubées pendant environ 2 à 4 heures.
- La détection de ce kit dépend de la réaction catalysée par la déshydrogénase. S’il y a plus d’agents réducteurs dans le système à détecter, par exemple, certains antioxydants interfèrent avec la détection, essayez de les éliminer. Le milieu contenant du rouge de phénol n’affecte pas la détermination de la viabilité cellulaire dans ce kit.
- Comment déterminer si la solution à tester est réductible ? Ajouter 10 ul de solution de CCK-8 aux puits de la solution d’essai sans cellules, incuber pendant 1 à 4 heures et mesurer l’absorbance du blanc à 450 nm. Si l’absorbance est faible, cela signifie qu’il y a moins d’agent réducteur dans le système à tester, et CCK-8 peut être directement ajouté dans le test formel ; si l’absorbance est relativement grande, cela signifie qu’il y a plus d’agents réducteurs dans le système à tester, et le système à tester est formellement testé. Dans ce cas, il est nécessaire de retirer le milieu, de laver les cellules deux fois avec le milieu, puis d’ajouter du nouveau milieu et 10 µl de CCK-8 pour la détection.
- Si l’échantillon est une suspension cellulaire avec une turbidité élevée, il est recommandé de définir 600 nm (ou au-dessus de 600 nm) comme longueur d’onde de référence et de soustraire la valeur O.D de la longueur d’onde de référence.
- Veuillez porter une blouse de laboratoire et des gants jetables pour l’opération.
